一、实验器具与材料:
1、移液qiang:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头:1ml、200μl、20μl 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个 5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖);1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、试管架:5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水 11、铝制饭盒:4个 12、塑料小饭盒:1个 13、大瓷缸:2个 14、锡泊纸:一卷 15、卷纸:2卷 16、三角烧瓶:带盖,稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品:(包括qiang头、EP管、匀浆管等) 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小qiang头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将qiang头等放入吸头台,再高压一次(EP管) 2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干) 3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)
三、试剂配制: 1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压) 3、异丙醇:放入棕色瓶中 4、氯&仿:放入棕色瓶中 5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制:
1、电泳缓冲液: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml 5×TBE (贮存液) 再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液: 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液,4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制: 1、1.0%: 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的Rt-PCR材料: Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1支 110 -- -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies -- 4℃ Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00
七、引物合成
1. 正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′ 反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′ 2、par-4: 正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′ 反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′ 3、退火温度计算 2(A T) 4(G C) 正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃) 4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好 5、引物稀释: 加DEPC水量为(μl)= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳 先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点: 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。 2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前,打开离心机预冷。 |