牛体外受精胚胎冷冻与解冻孵化试验报告

　　当前，牛体外受精技术体系己基本确立，并逐步进入实用化商业化，其胚胎生产主要在实验室内完成，并且不受季节限制；胚胎移植却有定的季节性，而且地点分散。胚胎冷冻保存即解决了胚胎4产移植在时间和地域方面存在的码，成为两者之间的桥梁，在整个家帘胚胎小物技术领域中占重要地位。笔者于1998年6月月在曰本学习家畜体外受精技术时，利用当地生物技术实验室的有利资件，将培养到胚的部分牛体外受精胚胎逃行了冷冻孵化试验。现将试验内容报如下1材料与方法l.J试验1牛体外受精胚胎的冷冻保存1.1.1牛体外受精从屠宰场回收日本和牛与黑白花奶牛杂交代⑴彡肉牛卵巢用注射器吸取法采取卵母细胞。将卵母细胞放入5犊牛血清，5缓冲99的培痄液。38.55.，295空气饱和湿度条件下成熟培养20 22精卞获能处理为8液，咖啡人1 1.成熟卵子放入1000万精子浓度的获能悬浮液滴，在与成熟培养相同条件下受精培养61！
　　再返回成熟培养液共培养法，第7天和第8天获得囊胚期81或扩张囊胚期胚胎，质量鉴定为入级的用于冷冻保存。
　　1.1.2冷冻保护液说和脱甘油液的制备取8，1保存的215和81呢含青霉素和链霉素各两支，38.5，温水溶解后各取支分别混合变成两支1的1胳3溶液。向其中支试管标注5加鹿糖1.，80.31；另试管标注肘加蔗糖0.68580.2加盖轻微颠倒试管，使鹿糖溶解。从河试管中吸取1溶液丢弃，用吸管吸取甘油1361.加入纟1试管并反复冲洗多次。两种溶液分别过滤灭菌注入培养515253和河2河3备用。
　　1.1.3胚胎处理经观察评定为，级的胚胎，8从培养液移入河1液，与此同时平衡时间30，计时开始。用鼠尾细管将胚胎移动几个位置冲洗后移入河2液，观察胚胎形态变化，基本上能够恢复原来形状约需58，的，才可以装细符逃，冷冻。
　　4塑料细管的冲洗装液和装胚取火馆的冷冻用0.25，塑料细管。由棉塞端接，1注射器，用31液冲洗两次后，按下装液和装胚。吸入，后用滤纸沾立细管口的佘液，然后吸液，最后用电热钳封严，作好标记。
　　棉塞注空。，3溶液。厘3鼠，溶液。822溶液。
　　1.1.5胚胎冷冻程序使用1本产叫1型胚胎冷冻机冷冻液为乙醇，在配制冷冻保护液之前斤机。选择冷冻程序32，冷冻液温役下降并保持在7±0.3.从胚胎放入河1液后3，1开始计时，30结束后，立即将胚胎细管插入冷冻液内的固定架孔中，热封端诩上。冷冻开始。弟步为7稳定冷冻1.在第2山1时，用经液氮降温并衡定的备用镊子于上端植冰238，然后将固定架放置横向，检查确定冰晶形成，1结束后温度自动以0.5，1下降，经过32min达到23C，再自动以23C稳定冷冻1结束蜂鸣，冷冻结束，取出细管投入液氮。
　　1.2试验2牛体外受精冷冻胚胎的解冻与化培养1.2.1冲洗甘油液和孵化液制备脱1油冲洗液1.2.2胚胎解冻与脱甘油从液氮中取出细管，在空气中轻轻摇动568，投入38，温水中3，8左右取出擦干，用酒精棉消毒。竖立细管热熔封闭端上指甲将液全部弹至液中。
　　1.2.3胚胎的冲洗和孵化用消毒过的切刀将细管从53处剪断，将细管中的溶液从人3端吹出至培养盖上，立体显微镜下寻找到胚胎并将胚胎移至1呢05液。换几个位置的同时观察胚胎内部形态和复原情况，确定是否存活。然后将存活的胚胎移至HamFK厂FCS液中，放入培养箱，38.5C 5，295空气饱和湿度环境下孵化2你48，分别观察胚胎成活倩况。
　　2试验结果2.1胚胎冷冻1胀胎冷冻机可以设定多个程序，开机后确认己经设定好的程序3.本试验共冷冻操作7次。冷冻胚胎3枚及1.
　　冷冻日期冷冻胚胎数解冻日期解冻存孵化24小时存活化48小时存活合计2.2胚胎解冻与孵化解冻与孵化培养是同时进行的，解冻前配制培养液，解冻后成活的胚胎进行孵化培养。7月23日和24日两次冷冻的胚胎于7月28日合并次解冻孵化。冷冻保存胚胎解冻后存活27枚，平均存活率为902730.培养24小时共存活21枚，存活率为77.8227；孵化48小时共存活3讨论3.1冷冻方法犯，1等1982首次使用蔗糖除去冷冻保护剂，如等1982在细管内用蔗糖稀释冷冻保护剂，受体率达到5，此后，1984报道采用试管内除冷冻剂方法大规模冷冻胚胎和移植化，从而促进了胚胎生产和移植技术的飞速发展。
　　采用步试管法慢速冷冻，除胚胎质量和保护液稀释液成分外，冷冻起始温度冷冻速度及投入液氮时的温度等也与冷冻效果有密切关系。从过去研究者的众多试验看，所采用的方法虽然各不相同，但多数将胚胎置于0至7的冷冻液中，以80，投入液氮。本试验冷冻程序在国内尚未报道，其冷冻效果比较理想，胚胎解冻后存活率达到90.0，孵化24存活率达到77.8.
　　3.2冷冻保护剂牛胚胎冷冻最常用的保护剂有甘油乙醇和甲基亚砜150等3种物质。般来讲。常规刖效果好，止1早等1992论述油是用于卞胚胎冷冻最好的冷冻保护剂等观察用甘油作冷冻保护剂的胚胎存活率比0河50高。另有研究认为，使用乙醇做保护剂的效果与甘油相接近。究竟使用哪种冷冻保护剂效果最好，应根据冷冻方法的不同，通过多次实验进行验证。日本宫城县畜产试验场多年来直使用甘油作冷冻保护剂，效也比较好。
　　3.3平衡时间冷冻开始前先将胚胎放入冷冻保护，中。使冷冻保沪剂渗透到细胞质达到脱水的目的，质量好的胚胎脱水萎缩后能够较快地恢复原来形状，即达到渗透压平衡，平衡时间对冷冻效果也非常重要。有研究认为，以101.4甘油作抗冻剂，脱水平衡时间1030分钟能获得较高的生存率。本实验方法是将平衡时间较为严格地定为30分钟，这是当地技术人员经过大量试验总结出来的红似。
　　3.4抗冻剂的开发近年来国外正在研宄开发抗冻蚩3质3代6.1月1胚胎保办，该退白质存在于鱼昆虫等多种动物体内，具有抑制冰品形成的作。如果该虫1质能抑制胚胎玻璃化冷冻和解冻时冰晶的形成，那么将实现冷冻胚胎和冷冻精液样可直接移植的梦想，受胎率也会得到