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杀虫剂的酶促降解及其研究进展
杨庆贵1 ，苏小建2 ，朱昌亮3
( 1． 江苏出入境检验检疫局，江苏南京210001; 2． 南京出入境检验检疫局，江苏南京211106;3． 南京医科大学，江苏南京210029)
摘要: 杀虫剂被广泛使用以来，对生态环境的污染、食物中的农药残留等问题引起人们日益关注，研究杀虫剂的酶促降解将为解决杀虫剂污染及残留提供新的途径，本文对常见几类杀虫剂的酶促降解及其研究进展予以综述。
关键词: 杀虫剂; 酶促降解; 研究进展
中图分类号: S482． 3 文献标识码: A 文章编号: 1671-2781( 2014) 03-0287-06
昆虫对杀虫剂的降解是其抗药性形成的主要机制之一，也为我们消除杀虫剂残留提供新的思路。目前报道的降解杀虫剂的主要方法包括生物降解( 微生物降解、酶促降解、降解酶基因工程菌降解等) 、化学降解( 臭氧降解、过氧化氢降解等) 、光化学降解( 光敏化氧化、光激发氧化、光催化氧化等) 、超声降解和电离辐射降解等，其中以杀虫剂的酶促降解最为重要［1］。因此，研究有机杀虫剂的酶促降解将为解决杀虫剂污染及残留提供新的途径。迄今为止，常用的人工合成有机杀虫剂主要包括有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类。现对以上几类杀虫剂的酶促降解及其研究进展综述如下。
1· 有机氯类杀虫剂的酶促降解
有关HCH 的酶促降解过程报道较多，可分为上游途径( up stream pathway) 和下游途径( down streampathway) ［2］。上游途经是指在脱氯化氢酶和氯化物水解酶的作用下由HCH 产生对氯对羟基己二烯，该过程中脱去四分子的氯化氢并从水分子中加入两个羟基而使溶液酸化，继而对氯对羟基己二烯被还原为对氯对苯二酚，进入下游途径。下游途径是指在对氯对苯二酚还原酶和双加氧酶的催化下产生2 －酮己二酸，最终产生二氧化碳和水，该反应过程首先以氯化氢的形式脱去两个氯分子，产生对苯二酚，然后在氧的参与下由双加氧酶打开苯环产生带羟基的己二烯二酸，还原产生3 － 酮己二酸。γ － HCH 是一种高度氯化的化合物，每个分子含有6 个氯原子，其降解过程中最重要的步骤是脱氯［3］。γ － HCH 的降解基因最先发现于Sphingomonas paucimobilisUT26 中，并被命名为lin 基因［3］。已知Sphingomonaspaucimobilis UT26 的γ － HCH 降解基因和酶包括: linA、linB、linC、linD、linE、linF 6 个结构基因。此外，还鉴定了linX，它编码的蛋白质活性和LinC 相似。
DDT 降解机制主要为还原性脱氯，在还原酶的作用下使DDT 烷基上的氯以氯化氢的形式脱去，导致溶液酸化。Ｒanson 等自冈比亚按蚊( Anophelesgambiae) 的DDT 抗性品系分离出谷胱甘肽S － 转移酶( Glutathione S － transferase，GSTS) 新基因aggst3－ 2，其mＲNA 水平比敏感品系高出约5 倍，发现重组的agGST3 － 2 有很强的脱氯化氢能力，故推测GSTⅢ家族在冈比亚按蚊的DDT 抗性中发挥重要作用。目前在果蝇的一个大约14 kb 的DNA 链上已发现有10 个GSTⅢ家族成员连锁，据此推测冈比亚按蚊GSTⅢ家族可能远不止上述基因，而这一基因家族的多个成员均受一个共同的调控因子调控，该调控因子的突变导致GST 酶活性的升高［4］。Ortelli还发现GSTE2 － 2 蛋白在DDT 抗性的冈比亚按蚊体内高表达，并且通过大肠杆菌表达出的GSTE2－ 2 蛋白可以在体外代谢DDT［5］。Lumjuan 等也发现埃及伊蚊DDT 抗性品系( PMD － Ｒ) 的GSTe2 基因在除雄性成蚊外各期的表达水平均明显上调，且体外重组表达的GSTE2 蛋白具有降解DDT 能力［6］。目前，对DDT 降解菌的酶学研究主要涉及负责打开苯环的双加氧酶，该酶催化苯环的间位裂解，这也是DDT 降解的关键步骤。此外，细胞色素P450( cytochrome P450，CYP450) 是昆虫体内参与各类杀虫剂和其他内、外源化合物代谢的主要解毒酶系—多功能氧化酶系的末端氧化酶。因为各类杀虫剂均涉及氧化代谢，故其抗性均与P450 相关，尤其是DDT 抗性的产生［7］。Berge 等发现黑腹果蝇( Drosophila melanogaster) DDT 抗性品系的CYP6A2含量比敏感品系高40 倍，基因测序后发现精氨酸－335 － 丝氨酸、亮氨酸－ 336 － 缬氨酸和缬氨酸－ 476－ 亮氨酸3 个点突变［8］。为检测这些突变对CYP6A2 蛋白功能的影响，笔者在大肠杆菌内分别表达了野生型以及突变型( 包括单突变、双突变和三突变) 的CYP6A2 蛋白，结果发现: 所有突变型蛋白均较野生型蛋白不稳定，野生型和突变型蛋白均可将睾酮的2β 位羟化，但它们的羟化能力没有区别。同时，三突变型的CYP6A2 蛋白代谢DDT 的作用显著增强，其代谢产物为氯苯三氯乙醇、二氯二苯二氯乙烷和对( 对氯苯基) 醋酸。Daborn 等利用基因芯片和ＲT － PCＲ 技术研究了黒腹果蝇( D． megalogaster)DDT 抗性机理，发现抗性品系CYP6G1 高转录，其mＲNA 水平是敏感品系的10 ～ 100 倍［9］。Brandt 等对果蝇DDT 抗性和敏感品系6 个P450 基因表达水平进行研究，发现了两个P450 结构基因过表达( CYP6G1: 4． 3 倍; CYP12D1: 6 倍) 。同时，CYP12D1 可被DDT 诱导高表达( ≥6 倍) ，而CYP6G1 则不被诱导，表明二者的调控机制不同［10］。Pedra 等也通过全基因组基因芯片研究发现，除CYP6G1 外，还有多个基因在野外和实验室的DDT 抗性果蝇体内高表达，提示果蝇的DDT 体内降解及其抗药性形成比以前认为的要复杂许多［11］。
2· 有机磷类杀虫剂的酶促降解
有机磷含有3 个磷酯键，常被称为磷酸三酯，一般分为两种类型: 一类是磷通过双键与硫结合( P =S) ，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、水胺硫磷等; 另一类是磷通过双键与氧结合( P = O) ，如敌敌畏、氧化乐果、甲胺磷等。生物体内存在多种不同的有机磷降解酶，如有机磷水解酶、有机磷酸脱水酶等，而有机磷杀虫剂的酶促降解主要通过氧化与水解来实现，其中参与解毒的最常见酶类是磷酸三酯酶( phosphotriesterases，PTE) 和羧酸酯酶［12］等。X－ 射线晶体结构显示，磷酸三酯酶为同型二聚体，整个分子结构为不规则的( α /β) 8 桶状。每个单体C末端有相同的活性位点，每一活性中心含有1 个金属阳离子Zn2 + ，其中1 个Zn2 + 与2 个组氨酸残基和1 个天冬氨酸( Asp301) 相连，另1 个Zn2 + 与2 个组氨酸残基相连［13］。有机磷降解酶( organophosphomshydrolase，OPH) 水解有机磷酸酯( 以对氧磷为例) 的机制为: 有机磷酸酯的磷酰基氧与PTE 中金属离子形成配位键，减弱金属离子与羟基化合物的结合，磷酰基氧与金属离子结合的同时使磷酰基中的键极化，磷的亲电性加强，Asp301 接受质子帮助相连的羟基化合物的亲核攻击，磷与离去基团的键变弱，P= O 等键断裂［14］。PTE 为广谱降解酶，能以不同的催化速度断裂P － S、P － F 等键，在水解手性有机磷酸酯类化合物时具有较高的立体选择性［15］。
早在1974 年，人们已从假单胞杆菌中检测出磷酸酯酶的活性，同时发现其对对硫磷具有降解作用。进一步研究发现这些微生物之所以能降解有机磷类杀虫剂是因为它们能分泌一种能水解磷酸酯键的有机磷降解酶，该酶又称磷酸三酯酶、对硫磷酶等，在22 ℃时对8 种有机磷类杀虫剂的水解速度比化学水解快约40 ～ 2 500 倍。而且，有机磷降解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，如来源于假单胞菌的降解酶在10% 无机盐、1% 有机溶剂、50 ℃条件下仍能保持高活性，而该酶的产生菌在同样的条件下却不能生长［16］。此后，有关该酶降解有机磷的相关研究有较多报道: Brown 等对来源于黄杆菌( ATCC 27551) 的有机磷农药降解酶进行了部分纯化并对酶的性质进行了初步研究，发现其反应的最适pH 范围在8 ～ 10 之间; 该酶的活性不受金属离子的影响，可被非离子去污剂抑制［17］。Ｒichard 等( 2000) 构建了与纤维素结合区( cellulose－ binding domain，CBD) 融合的OPH，利用融合蛋白一步纯化并固定于纤维素类基质上的特性，可非常方便地使用该酶［18］。Chi － Fang Wu 等［19］用基因融合技术固定OPH 与组氨酸( His6) － 绿色荧光蛋白( green fluorescent protein，GFP) 汇报子－ 肠激酶( enterokinase，EK) 融合元件，对硫磷通过装有OPH酶系的层析柱时被快速降解。pH6． 9 的CHES 缓冲液中，GFP 荧光可监测OPH 的活性，用磷酸缓冲液洗脱对硫磷，OPH 和GFP 的活力均上升。因此，固定化的OPH 具有稳定性高、降解效率高、分离回收容易、可多次重复使用等特点，同时具有节省资源与能源、减少或防治生态环境污染等效应，在生物处理有机磷农药污染领域中有广泛的应用前景。
除PTE 外，不断有新的有机磷降解酶自细菌体内被分离。Mulbry 等自3 株革兰氏阴性菌中提取到3 个对硫磷水解酶，分别测定分子量后，进一步对其酶学性质做了研究。结果显示，此3 个酶分子量不同，对不同底物的作用也不同［20］。同年，Dumas 等纯化得到来源于假单胞菌的有机磷农药降解酶，发现该酶为分子量39KD 的单体球蛋白，有一个锌离子，可被巯基试剂抑制，金属螯合剂、EDTA 等可使其失活［21］。1993 年，Tu － chen cheng 等从单胞菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量为53KD，对含磷氟键和磷碳键的有机磷化合物作用较好，其反应最佳pH 为8． 0，最适温度为55 ℃［22］。以上这些研究使人们对有机磷降解酶的结构及作用机理均有进一步了解。此外，Haubruge 等发现赤拟谷盗( Tribolium castaneum) 一个马拉硫磷抗性品系的羧酸酯酶( MCE) 水平较敏感品系升高了44 倍，而非特异性酯酶水平轻度下降。抗性和敏感品系赤拟谷盗的MCE 仅占其总可提取蛋白的0． 03% ～ 0． 045%。
对抗性和敏感品系的MCE 纯化后发现其分子量相近( 62 000) ，等电聚焦试验发现抗性和敏感品系MCE 的pI 值分别为7． 3 和6． 6，但它们水解马拉硫磷和α － 醋酸萘酯( α － naphthylacetate) 的K( m) 和V( m) 值不同，动态分析发现: 抗性品系的MCE 水解马拉硫磷更快，且其与马拉硫磷的亲和力较萘酯更强。据此可知，赤拟谷盗的马拉硫磷抗性与酯酶的改变相关［23］。Zhu 等研究了密西西比一个对马拉硫磷具有11 倍高抗性的美国牧草盲蝽( Lygus lineolaris)品系的酯酶水平与其抗药性的关系，结果发现联合使用S，S，S，－ tributylphosphorotrithioate( DEF) 和triphenylphosphate ( TPP) 这两种酯酶抑制剂可以使美国牧草盲蝽对马拉硫磷的敏感性提高80%以上。定量PCＲ 结果显示，抗性品系酯酶mＲNA的表达较敏感品系高5． 1 倍［24］。
近年来，一些新的有机磷水解酶基因相继被发现。Cui Zhongli 等从Plesiomonas sp． M6 的基因文库中克隆了一种新的有机磷酸酯水解酶基因mpd，并测定了它的核苷酸序列，mpd 在E． coli 中能够高效表达，且Plesiomonas sp． M6 能将甲基对硫磷水解为对硝基苯酚［25］。Shimazu 等将编码冰核蛋白－ 有机磷水解酶的穿梭质粒pPNCO33 转入能在PNP 中生长的Moraxella sp． 菌中，使得该菌具有在10 h 内快速降解有机磷酸酯的能力［26］。Horne 等从Pseudomonasmonteilli C11 中发现了一个新的磷酸三酯酶基因，它编码的磷酸三酯酶活性不受钒酸盐和EDTA的影响［27］。opd 基因的上游有一段插入序列( insertion sequence，IS) ISF1sp1，下游为编码OPH和转座酶TN3 样元件，与opd 相连但转录方向相反的开放阅读框( open reading frame，orf) orf 243 编码芳香族水解酶，它们组成一个复杂的代谢转座子。其中orf 243 编码1 个27kDa 的多肽，它在硝基酚的降解中有重要作用，而且可能与opd 基因一起降解对硫磷［28］。为提高OPH 在E． coli 中的表达和分泌，人们对OPH 的前导序列进行了大量的定点突变工作［29］。Catherine 等通过对E． coli 的环状DNA进行两轮重排和筛选，提高了OPH 的活性。通过冰核蛋白将OPH 展示在E． coli 表面，用固相琼脂的方法检测黄色产物对硝基苯酚，筛选出的突变株22A11 水解甲基对硫磷的速度可达野生型的25倍［30］。因此，新基因的研究和应用将扩展有机磷的酶促降解谱，促进基因工程菌的构建。
3· 氨基甲酸酯类杀虫剂的酶促降解
氨基甲酸酯类杀虫剂的酶促降解机制和有机磷类相似，主要包括水解和氧化两种途径，其中羧酸酯酶的水解作用是最为有效的降解途径。氨基甲酸酯类易被羧酸酯酶降解为乙醇和氨基甲酸，后者又即刻分解为二氧化碳和甲胺［12］。
研究人员先后从芽生杆菌属( Blastobacter) ［31］、节杆菌属( Arthrobacter) ［32］、假单胞菌属( Pseudomonas)、细球菌属( Micrococcus) ［33］等菌体内分别提取大量可降解氨基甲酸酯类杀虫剂的羧酸酯酶。一些羧酸酯酶的氨基酸序列与其他真核酯酶具有很高的相似性，除可水解氨基甲酸酯类外，这些提取酶还可降解4 － 硝基苯基乙酸酯、乙酸－ 2 － 萘酯、硝基酚丁酸盐等其他羧酸酯类［31， 32］。Douch 等分别研究了N － 叔丁基氨基甲酸酯在小鼠及家蝇( Musca domestica)、丝光绿蝇( Lucilia sericata) 、新西兰草地蛴螬( Costelytra zealandic) 、意大利蜜蜂( Apis mellifera)、谷粉虫( Tenebrio sp． ) 等5 种昆虫体内的代谢情况，叔丁基和N － 甲基两个基团均可被羟基化。经质谱鉴定，其主要酚类代谢产物是β 羟基叔丁基酚。自酶氧化反应开始，便持续形成大量的二羟基化合物。此外，NADPH － 依赖的微粒体酶也参与催化酯键断裂反应。Chapalmadugu 等通过离子交换、磷灰石纯化、凝胶过滤、疏水作用层析等方法从铜绿假单胞菌分离纯化出一种可以将胺甲萘转化为1 －萘酚的氨基甲酸酯类降解酶，这也是人们从细菌中提取获得的第一个降解氨基甲酸甲酯的膜结合水解酶。该酶的分子量为65kD，其发挥降解作用的最适温度为45℃，最适pH 值为8． 5。经测定，此酶以胺甲萘为底物的米氏常数和最大反应速度分别为9μm 和7． 9 μmol /( min·mg) ［34］。
随着分子生物学技术的发展与应用，也发现了一些新的氨基甲酸酯类杀虫剂的降解酶基因。Scharf 等从对西维因( carbaryl) 和甲基对硫磷抗性和敏感的western corn rootworms 中克隆和测序了3个新的CYP4 家族成员( CYP4AJ1，CYP4G18 和CYP4AK1) 。其中CYP4AJ1 和CYP4G18 均从基因组的PCＲ 和ＲT － PCＲ 产物克隆得到，且只有CYP4AJ1 具有内含子。推导的氨基酸序列与其他同源昆虫的CYP4 有很高的同源性。混合探针Northern 杂交发现抗性品系3 个CYP4 片段的mＲNA转录水平升高并且可被PBO 诱导，进一步提示CYP4 家族的高水平转录与抗性相关［35］。
4· 拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促降解
Maloney 等从以吐温80 为C 源的无机盐基础培养基中分离到Bacillus cereus SM3 菌株，用该菌粗酶液降解拟除虫菊酯，结果显示: 该菌能够降解第2代和第3 代拟除虫菊酯杀虫剂，和降解反应有关的酶称为氯菊酯酶［36］。氯菊酯酶降解拟除虫菊酯类杀虫剂的最适pH 为7． 5，最适温度为37 ℃，无需辅酶及辅因子便具活性。用离子交换柱和凝胶层析柱分离纯化得到氯菊酯酶，经交联葡聚糖G － 100 凝胶层析测定，分子量约为61． 3 kDa，为羧酸酯酶。已有研究表明，用酶对拟除虫菊酯类农药进行脱毒和解毒，发现支链的氧化及酯键的水解将导致拟除虫菊酯类农药的解毒，而羧酸酯酶在此过程中则起重要作用［12］。
近年来，不断有新的拟除虫菊酯类杀虫剂降解酶基因被发现。Zhu 等从拟除虫菊酯抗性和敏感品系的细线椿象( Lygus lineolaris) 中克隆了3 个cDNA，它们均包含1548 bp 的开放阅读框( OＲF) ，编码516 个氨基酸，推导的P450 属于CYP6X 家族，分别命名为CYP6X1V1 ( 敏感品系) 、CYP6X1V2 和CYP6X1V3( 2 个抗性品系) 。推导的CYP6X1s 与其他昆虫拟除虫菊酯抗性相关的CYP6s 同源性＞42%。在敏感和抗性品系的cDNA 中发现26 个点突变，其中两个突变导致了氨基酸置换( 天冬氨酸－ 373 － 丙氨酸，丝氨酸－ 487 － 丙氨酸) 。抗性品系每毫克总ＲNA 中的P450 mＲNA 比敏感品系高2． 1 倍。这些结果提示P450 基因的突变及表达上调与细线椿象的抗性相关［37］。Nikou 等自冈比亚按蚊克隆了一个成蚊特异性的CYP6Z1 基因，该基因定位于3 号染色体右臂一个大的P450 基因簇内。该基因在拟除虫菊酯抗性品系的雄蚊和雌蚊的表达分别较敏感品系的雄蚊和雌蚊高11 倍和4． 5 倍，同时其在雄蚊体内的表达较雌蚊高。Southern 杂交结果显示该基因的高表达是由discounted gene amplification造成的［38］。
为研究淡色库蚊( Culex pipiens pallens) CYP4 家族与溴氰菊酯抗药性的关系，朱昌亮等采用一对昆虫CYP4 简并引物，以ＲT － PCＲ 从淡色库蚊扩增特异片段，T /A 直接克隆法筛选阳性克隆，并对新序列进行cDNA 芯片和逆Northern( reverse Northern) 分析。共获得24 个P450 新序列，分属CYP4 家族CYP4C、CYP4D、CYP4H 和CYP4J 等4 个亚族; 24个CYP4 cDNA 片段中，6个片段的cDNA 在抗性品系的表达高于敏感品系，倍数在3． 1 ～ 9． 7 之间。此外，还有1 个片段仅与抗性探针杂交，与敏感探针产生阳性反应的两个等位基因相比，其存在一个T 被A 取代的突变，导致丝氨酸－ 75 － 苏氨酸突变。这些结果表明，淡色库蚊CYP4 家族与溴氰菊酯抗性相关，在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中可能存在基因点突变而导致的特异表达［39］。
5· 重点研究方向及展望
因受自然条件的影响，许多杀虫剂虽可被天然菌株降解，但其对农药的降解率较低或作用较慢，故直接利用分离的微生物菌株往往不能达到期望效果。应用现代生物工程技术改变酶的性质( 如酶的细胞定位、底物特异性、动力学特征) ，构造符合不同需要的酶制剂，可望能够更为有效地利用杀虫剂酶促降解技术来协助实现杀虫剂污染环境的生态修复、清除杀虫剂残留和救治杀虫剂中毒等目的。今后重点研究方向包括以下几点: ① 降解酶或降解基因的改良: 人们直接从自然界中筛选得到的降解酶活性往往较低，不能满足实际需要。可以通过定向诱变、随机突变或DNA 改组以及加入强启动因子等分子生物学技术提高其活性，以增强降解菌对农药的降解能力。其中，DNA 改组技术是1994 年由美国Stemmer 博士首先提出，是一种在试管中模拟达尔文进化的过程，该技术可以大幅度地提高降解酶的活性，而又不需要知道酶的三维结构［40］。DNA改组技术自诞生以来，得到了迅猛发展和广泛应用，美国已将该技术应用于去除农药污染物。加入强启动因子可以提高降解酶基因的表达，有利于降解杀虫剂。② 降解酶谱的拓展及广谱降解酶的筛选: 国内外虽已开展较多酶促降解杀虫剂的研究，但尚未真正获得广谱高效的降解酶，与实践应用还有一段距离。应重点开展高效降解酶筛选及其降解特性与制剂研发等内容的研究。③ 酶的固定化研究: 固定化为杀虫剂降解酶提供了固定支持物，制成的酶反应器可用于目标杀虫剂的脱毒，且可重复使用。④优化反应条件，提高降解酶活性: 研究反应条件对降解酶活性的影响是项重要内容，旨在摸清相应杀虫剂降解酶的最佳反应条件。⑤ 对杀虫剂酶促降解产物的深入研究: 目前，对杀虫剂本身的危害已经研究得较为透彻，但对其代谢产物的危害研究尚存不足，需要在研究杀虫剂降解途径基础上，着重对代谢产物的毒性进行研究，特别是对代谢产物的持久性及其对环境的污染及非目标生物的潜在危害的评价，以建立完整的杀虫剂危害评价体系。
随着分子生物学及相关技术的迅速发展，去除杀虫剂污染研究也取得了较多进展［12］，在各种去除杀虫剂污染的措施中，酶促降解虽受杀虫剂种类、环境条件等因素的限制，但因其具高效、安全、无二次污染等优点而具有广阔的发展前景，必将在杀虫剂残留和杀虫剂耐药的治理工作中起到积极作用。
参考文献：略
