磺酰脲类除草剂的微生物降解研究进展

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磺酰脲类除草剂的微生物降解研究进展
吴春先，聂果，高立明，王广成，陈丙坤，许艳秋，李婷
（四川省农药检定所，四川成都610041）
摘要：磺酰脲类除草剂是使用最广泛的除草剂之一。微生物降解是磺酰脲类除草剂在土壤中降解的重要方式。本文简要概述了土壤微生物对磺酰脲类除草剂的降解、降解机理及影响微生物降解磺酰脲类除草剂的因素。
关键词：磺酰脲类除草剂；微生物；降解
中图分类号： S482.4 文献标识码： A 文章编号： 1002-5480 （2014）09-11-08
1· 引言
Levitt （1978）[1]与Finnerty （1979）[2]最早报道了N- （1，3，5 三氮苯基氨基羰基）苯磺酰胺的活性，并由美国杜邦公司于1982年开发了第1个磺酰脲类除草剂品种—氯磺隆（clorsulfuron）。由于其生物活性超过传统除草剂的100～1 000倍，使用量以g/hm2计。因此，拉开了超高效除草剂开发、应用的序幕，使除草剂的研发应用进入了超高效时代。目前世界上已开发了40 多种磺酰脲类除草剂，其中商品化的有30多个品种。
磺酰脲类除草剂与其它类别的除草剂或农药种类相比，具有四个突出特点：一是使用范围广、除草谱宽；二是生物活性高、使用量极低，使用方便。除个别品种外，磺酰脲类除草剂的活性比传统除草剂高出100~1 000倍，一般每公顷有效成分用药量在5~100g之间，目前已发现了用量在1g以下的品种，是一类超高效除草剂；三是对人畜低毒，对使用者和动物安全性良好；四是对环境友好。
磺酰脲类除草剂一问世就受到世界各地的普遍欢迎，推广使用面积快速增长。磺酰脲类除草剂占世界除草剂的份额也逐年上升，从1998年的9.2%增长到2003年的的12.2% （2003世界除草剂销售额134亿美元）， 2003年磺酰脲类除草剂占乙酰乳酸合成酶抑制剂市场的70%。目前，磺酰脲类除草剂己广泛应用于水稻、麦类作物（小麦、大麦）、大豆、玉米、油菜、甜菜、甘蔗、谷子、蔬菜等多种作物田，以及草坪、林业和其他非耕地，苗前、苗后茎叶处理，有效防除多种阔叶杂草、禾本科杂草、莎草科杂草等。磺酰脲类除草剂成为世界上开发成功品种最多一类除草剂，使用量仅次于有机磷类除草剂[3-4]。
磺酰脲类除草剂由芳环、磺酰脲桥和杂环三部分组成，为内吸传导型选择性除草剂，通过作用于植物体内的乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制植物根和幼芽顶端生长，从而达到杀死杂草的目的。由于它具有极高的活性和极强的选择性，一些品种如氯磺隆、氯嘧磺隆、胺苯磺隆等在土壤中少量的残留即可对后茬敏感作物产生药害，因此该类除草剂在土壤中的残留对后茬作物的安全性等问题引起了人们的普遍关注。国内外研究表明，磺酰脲类除草剂在土壤中的降解方式有光解、化学水解和微生物降解。然而，磺酰脲除草剂光解作用很少，且发生在土壤表层，在较深土层中几乎不发生。在酸性和中性土壤中，磺酰脲除草剂的消失主要是微生物降解和化学水解共同作用的结果；而在碱性土壤中，主要起作用的是微生物的分解作用[5]。
2 ·土壤微生物对磺酰脲类除草剂的降解情况
很多实验证明，磺酰脲类除草剂在土壤中的降解都有微生物的参与。Jean等发现噻吩磺隆在不灭菌的土壤中能够迅速降解，而在高温灭菌土壤中的降解速度非常缓慢，表明土壤微生物在该除草剂的降解中起重要作用[6]。Joshi等发现，氯磺隆在环氧乙烷或γ-射线消毒后的土壤中降解速率显著降低，经土壤微生物的重新接种，其降解速率又恢复，表明了土壤微生物在其降解过程中起着重要作用[7]； Brown 等研究表明，土壤未灭菌时，噻吩磺隆降解50%需要1d，经过灭菌的土壤降解50%则需要50～70d[8]。Strek实验得出微生物降解是醚苯磺隆在土壤中消失的主要原因[9]。Miller等应用土壤微宇宙系统在灭菌和非灭菌条件下监测两个月来研究14C-氟嘧磺隆的降解，在0～5cm、20～25cm 的非灭菌土壤中，它的半衰期分别是2.1、3.4星期，而在同样的深度的灭菌土壤中，半衰期则大于七个星期[10]。甲嘧磺隆在土壤中苯环能够被降解成CO2， Anderson进一步推测甲嘧磺隆一开始的降解可能是由于在酸性条件下的水解，随后，微生物对其水解产物进行作用[11]。杨基峰等（2006）研究发现添加高效降解菌MD的灭菌土壤和灭菌土壤对比，甲磺隆的降解速率常数在10mg/L和1mg/L分别是7.52倍和3.61倍，添加MD的土壤中甲磺隆的半衰期缩短为灭菌土壤的13.4%和28.2%，说明在甲磺隆的降解过程中，降解菌MD在其中起着主要作用。自然土壤中甲磺隆的降解介于灭菌土壤和加菌的灭菌土壤之间，表明土著性微生物对甲磺隆的降解起一定作用[12]。郭正元（2006）和唐美珍等（2006）研究发现微生物对碘甲磺隆钠盐的降解作用十分强烈，在未灭菌的土壤中碘甲磺隆钠盐降解十分迅速， 15d后降解达80%以上，半衰期仅有6.0d。而在相同时间内，经过灭菌的土壤降解曲线下降平缓，降解速率减小，半衰期长达15.3d[13-14]。刘亚光等（2007）添加有益微生物群EM （Effective microorganisms）能加快土壤中绿磺隆的降解速率，而且EM的添加量越大，绿磺隆的降解速率越大[15]。胡立芳等（2007）研究发现接种甲磺隆高效降解菌株Penicilliumsp.的根际土壤（IP）中甲磺隆的降解半衰期为8.6d，其降解速率是对照未接种Penicilliumsp. 的根际土壤（OP）的2.7倍，根际灭菌土壤（SP）的10.13倍。非根际土壤接种Penicilliumsp. 后甲磺隆的降解速率也明显提高，接种Penicillium sp.非根际土壤（IN）的降解速率分别是未接种Penicillium sp.非根际土壤（ON）、非根际灭菌土壤（SN）的2.05、11.25倍[16]。刘辉等（2003）研究发现氯磺隆在非灭菌的土壤中11d内有95%被降解，而同等条件下的灭菌土壤中仅有5%的被降解[17]。滕春红等（2006）发现当分离得到的真菌F8 加到土壤中时，可明显促进氯嘧磺隆的降解，在28℃，土壤含水量20%，接种量20mL/kg时可使30μg/kg氯嘧磺隆的降解半衰期由自然条件下的46.52d缩短为15.03d[18]。黄星等（2008）研究发现降解菌S113 （Methylopila sp.）能够以甲磺隆为唯一碳源生长， 72h对50mg/L甲磺隆的降解率达98.38%。投加降解菌S113 可显著提高土壤中甲磺隆的降解速率。当甲磺隆浓度为10mg/kg干土， S113 接种量为108个/g土时，第30d土壤中甲磺隆降解率为76.9%，对照土壤中甲磺隆降解率仅为11.9%[25]。
3· 降解磺酰脲类除草剂的土壤微生物
降解磺酰脲类除草剂的土壤微生物主要是细菌、放线菌和真菌。Joshi等（1985）从土壤中分离得到对氯磺隆具有代谢作用的放线菌浅灰链霉菌（Strptomyces griseolus）、真菌黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉（Penicillium sp）等3种，并且还证实，黑曲霉和青霉能催化磺酰脲桥的水解，产生相应的磺酰胺和杂环[7]。Brown等（1997）又成功地从土壤中筛选出了7种可降解噻吩磺隆的微生物，其中4种为放线菌属， 3种为细菌属。液体培养时， 7种微生物能在3~8d内专一降解噻吩磺隆为噻吩磺隆酸[8]。Geraldine等从土壤中分离获得了Burkholderiacepacia，可水解噻吩磺隆[19]。沈东升等（2002）以甲磺隆为唯一碳源，从经甲磺隆驯化的潮土分离到4株细菌、9株真菌和20株放线菌。根据分离微生物的最大忍耐浓度和甲磺隆降解速率，筛选出其中的最优菌株F7，并初步鉴定为青霉属[20]。Kulowski等研究发现灰色链状真菌能降解氟磺隆[21]。周旭辉从经甲磺隆驯化的潮土中分离得到降解甲磺隆的优选菌株———青霉属F7[22]。马文漪等报道，假单胞菌能降解土壤中的氯磺隆和甲磺隆，使用放线菌浅灰链霉菌可以使甲嘧磺隆迅速地降解，并且产生了9种代谢产物[23]。丁伟等（2006）从农药厂排放的废水和污泥混合物中分离得到能够降解氯嘧磺隆的1株细菌，通过生理生化鉴定和16S rRNA序列分析结果显示：该菌株为睾丸酮丛毛单胞菌，命名为YW-1[24]。滕春红等（2006）从氯嘧磺隆驯化的土壤中分离出一株大豆田除草剂氯嘧磺隆高效降解真菌F8[18]。黄星等（2008）筛选出一株甲磺隆降解细菌S113 （Methylopilasp.），该菌能够以甲磺隆为唯一碳源生长[25]。沈东升等（2002）和胡立芳（2007）获得了一株甲磺隆降解真菌，属于青霉属（Penicilliumsp.）[16，26]。黄星等（2006）从生产噻吩磺隆的农药厂内土壤中采取土样，经驯化富集后筛选到1株能高效降解噻吩磺隆的细菌FLX，根据表型特征、生理生化特性及16S rDNA分析，鉴定FLX初步为寡养单胞菌（ Stenotrophomonas sp.） [27]。Gu等（2007）从除草剂生产厂的泥土中分离到一株能降解胺苯磺隆的细菌SW4，根据生理生化特性及16S rRNA分析，鉴定SW4初步为Pseudomonassp.[28]。ZANARDINI等（2007）从土壤中分离到了一株能降解绿磺隆和苯磺隆的细菌B2，属于Pseudomonas fluorescens[29]。Zhu等（2005）采用连续富集培养法从土壤中获得了一株能降解苄嘧磺隆的细菌BH，经鉴定属于Brevibacterium[30]。He等（2006）从土壤中获得了能降解甲磺隆的真菌DS11F，经鉴定属于Penicillium sp[31，35]。Zanardini等（ 2002）研究发现荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens） B1和B2混合培养的条件下，除草剂氯磺隆和甲磺隆的降解速度明显加快[32]。Boschin等（2003）研究发现黑曲霉菌（Aspergillusniger）对氯磺隆和甲磺隆的降解起作用[33]。Luo 等（2008）研究发现细菌（Brevibacteriumsp.）与不同碳源、氮源和磷源都能加快苄嘧磺隆的降解[34]。
4· 磺酰脲类除草剂微生物降解的途径
农药的代谢方式主要有酶促与非酶促方式，而微生物的降解作用主要是通过其分泌酶的代谢来完成，其本质为酶促反应，其中包括：（1）微生物以农药或其分子中某部分作为能源和碳源。部分微生物能以某种农药为唯一碳源和能源。有些农药能被微生物立即利用，有的则不能立即利用，需先经产生特殊酶后再使农药降解；（2）微生物通过共代谢作用使农药降解。由于某些化学农药的结构复杂，单一的微生物不能使其降解，需靠两种或两种以上的微生物共同代谢降解；（3）去毒代谢作用。微生物不是从农药中获取营养或能源，而是发展了为保护自身生存的解毒作用。另外，还有通过pH改变、辅酶或化学产物的降解[36]。常见的降解酶类主要有以下几种：（1）水解酶类：磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等。（2）氧化还原酶类：过氧化物酶和多酚氧化酶（酪氨酸酶、漆酶） [37]。目前，关于磺酰脲类除草剂的微生物降解机理主要集中于两方面的研究：
4. 1 共代谢
共代谢指微生物利用营养基质的同时将污染物分解代谢成无害物质，从而达到降解目的。共代谢过程的主要特点可以概括为：（1）微生物利用一种易于摄取的基质作为碳和能量的来源；（2）污染物作为第二基质被微生物降解；（3）污染物与营养基质之间存在竞争现象；（4）污染物共代谢的产物不能作为营养被同化为细胞质，有些对细胞有毒害作用；（5）共代谢是需能反应，能量来自营养基质的产能代谢，进一步的研究发现共代谢反应是由种类有限的几种活性酶决定的，即关键酶。而且，不同类型微生物所含有的关键酶的功能都是类似的。例如，好氧微生物中的关键酶主要是单氧酶和双氧酶，关键酶的具体反应特点包括：（1）关键酶控制着整个反应节奏，其浓度由第一基质诱导决定；（2）毒性中间产物抑制关键酶的活性微生物能够迅速启动自我修复功能以对抗毒性抑制作用；（3）微生物通过关键酶提供共代谢反应所需要的能量[38-39]。许多有机污染物是通过共代谢开始而完成降解全过程的，如放线菌浅灰链霉菌在磺酰脲类存在的情况下，可产生诱导性的共代谢，发生羟基化、O-去烷基化或去酯化反应。进一步对脱细胞提取液进行研究发现，放线菌浅灰链霉菌脱细胞提取液是依靠NAD（P）H进行磺酰脲类代谢，结果表明在浅灰链霉菌中存在着诱导性的、依赖细胞色素P450的磺酰脲代谢系统。在磺酰脲类除草剂存在下，放线菌浅灰链霉菌细胞中可溶性细胞色素P450的量大大提高，这是由于有一种主要的P450形态出现，这种形态的P450在用除草剂处理过后，数量增加，而且水解酶活性也加强[40]。Zanardini等研究发现，除草剂氯磺隆和甲磺隆作为唯一的碳源和能源，起始浓度为100mg/L，荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens） B1和B2混合培养的条件下，对氯磺隆和甲磺隆的降解率为11%、15%；而在共代谢的条件下，两周后荧光假单胞杆菌B2对氯磺隆和甲磺隆的降解率分别为21%、32%，这表明在共同酶作用下的降解作用更加明显[32]。Luo等（2008）在室内研究了不同碳源、氮源和磷源情况下苄嘧磺隆的微生物共代谢。结果发现碳源的添加能加速细菌（Brevibacterium sp.）对苄嘧磺隆的降解。与葡萄糖、蔗糖相比，乳酸钠是最好的碳源。氮源和磷源的添加都能提高苄嘧磺隆的微生物降解率[34]。磺酰脲类除草剂的水解产物可经微生物的作用完全降解为低分子量的化合物，苯环可降解为CO2，甲氧基三嗪环可开环降解为一未知产物， 14C酰嘧磺隆及其水解产物也可被土壤微生物利用，最终形成14CO2或其他产物。因此，微生物不仅可以直接降解母体化合物，还可以通过分解水的产物来促进水解反应[7，41-42]。
4. 2 水解
微生物通过分解水解产物促进化学水解，有些微生物还能催化磺酰脲桥的水解产生相应的磺酰胺和杂环，如黑曲霉和青霉[7，21，43]。Kulowshi等研究发现，利用灰色链状真菌降解氟磺隆时，作用于三嗪环水解甲基生成苄基醇，作用于芳香碳环3和4碳时生成酚和邻苯二酚，作用于丙基三氟化物侧链时生成另一种苄基醇。微生物降解磺酰脲除草剂的实质为脂肪族和芳香族的1次水解和2次水解，断裂异恶唑的N-C键及脱掉异恶唑环形成氯苯醇[21]。很多学者认为磺酰脲类除草剂在介质中首先水解，产生甲氧基三嗪环，然后微生物作用于三嗪环，打开环产生一未知产物。苏少泉证实了土壤微生物对水解产物中的苯环发生作用，使其降解为CO2，从而促进了水解[44]。Boschin等在室内条件严格控制化学降解的条件下研究了黑曲霉菌（Aspergillusniger）对氯磺隆和甲磺隆的生物降解，表明主要的代谢中间产物是通过磺酰脲桥的裂解获得，此外，真菌还能水解氯磺隆的苯环，甲磺隆唯一的代谢产物是三嗪环的衍生物的情况下，苯环被完全降解[33]。
5· 影响磺酰脲类除草剂微生物降解的因素
微生物在降解磺酰脲类除草剂中起着非常重要的作用，因此凡是能够影响微生物活动的因素都将影响它们的降解，如温度、湿度、pH 值、土壤微生物数量以及土壤有机质含量等[5，40，45，46]。
5. 1 pH值
pH可直接影响微生物群落种类及微生物数量等，从而对微生物的降解能力产生影响；而且不同的pH 值可通过改变磺酰脲类的存在形态，从而间接影响微生物的降解，如在酸性和中性条件下，磺酰脲类除草剂主要以中性型存在，这种形态对水解非常敏感，很易水解，随后微生物作用于水解产物，从这个意义上微生物降解和化学水解是相互促进；但在碱性条件下，则以阴离子型存在，水溶性较强，这种形态不易水解，此时主要微生物对磺酰脲类除草剂的降解起主要作用[5，45，47]。
Thirunarayanan等报道，在pH值为6.2、7.1、7.7和8.1时土壤中氯磺隆半衰期分别为38、60、82、99d[48]。Brown 进一步研究认为， pH值通过对磺酰脲类化合物在介质中存在的形式影响着化合物的降解方式[8]。姚东瑞等在研究太湖水稻土、砂姜黑土、高砂土的pH值依次递增，而降解速率依次递减，因而认为氯磺隆降解速率与土壤pH值呈明显的负相关[49]。据报道，土壤pH值5.5、6.7、7.6 时，胺苯磺隆在土壤中的半衰期分别为33、60、167d，差异非常明显[50]。碘甲磺隆钠盐在土壤中的降解以微生物降解为主，化学降解和光降解为辅，其降解速率pH值呈负相关[14]。
5. 2 微生物数量
具有降解污物能力的微生物数量多少直接影响着污染物的降解情况，大量的微生物可加速的污染物的降解[15]。Andersen 等研究发现甲磺隆、氯磺隆、苯磺隆、噻吩磺隆4种磺酰脲类除草剂在不同深度的土壤中，其降解的速率也不一样，其原因是由于随着土壤的加深，土壤的微生物数量也减少，因此认为应当注意其深处残留向下淋溶而导致污染地下水源[11]。Walker等研究氯磺隆和甲磺隆在土壤中的不同深度0～20、20～40、40～60cm的降解和吸附速率，发现两种除草剂的吸附与土壤的pH值成反比，而与土壤有机质含量成正比，两除草剂的降解速率一般地随土壤的深度增加而下降，它与土壤中微生物量成正比[51]。
5. 3 化合物结构
磺酰脲类除草剂的水解与化合物的结构有很大的关系[52]。结构相同的磺酰脲化合物分子型比阴离子型敏感250～1 000倍；不同结构的磺脲类除草剂化学水解的途径也不相同，含苯系芳的化合物易发生脲桥水解和杂环部分烷氧基的基取代反应[53，54]；芳基部分为杂环的化合物除脲的水解外，还可发生其他反应，噻吩磺隆可发生噻环上取代酯基的水解[55]；氯嘧磺隆可发生吡啶环的分子内亲核取代反应[56]；不同化学结构的磺酰化合物水解速度也相差悬殊，苯磺隆的噻吩取代芳基也容易水解[57]。近年来开发的麦田除草剂苯磺隆、噻吩磺隆初始降解速度比氯磺隆、甲磺隆快20~50倍，半衰期仅为7d左右，主要是由于化学结构的改变所致，从结构上看，苯磺隆和噻磺隆都是甲磺隆的“类似物”，区别在于苯磺隆的磺酰脲桥上多一个取代甲基，这一改变使苯磺隆在酸性和碱性条件下，磺酰脲桥对水解更加敏感，水解速度比“正常桥” 快10～25倍，所以虽在碱性条件下仍能迅速水解，而噻吩磺隆则以噻吩代替甲磺隆的苯环，此变化决定了噻吩磺隆在土壤中对微生物分解更加敏感[40]。 5. 4 温度、湿度
磺酰脲除草剂的降解速度受温度、湿度的影响。氯磺隆在土壤中的半衰期，10℃时64d， 30℃时9d， 45℃时0.4d[58]；烟嘧磺隆在20℃时的降解几乎是10℃时的2倍[59]； Dinelli等（1997）研究了4种磺酰脲除草剂的降解速度与温度的关系后得出，温度越高，降解半衰期越短[60]。磺酰脲类除草剂在土壤中的降解随湿度和温度的升高而加快，然而温度和湿度的作用是相互依赖的，且大多数时候还受其他相关因素的制约，温度、湿度的变化明显地影磺酰脲的降解及残留，而且不同化合物对温度、湿度具有不同的反应，因为温度、湿度影响着化合物在土壤水相中的可溶性及活性，从而影响降解速度；另外，温度、湿度也影响土壤中微生物活动及酶的活性，对微生物降解的速度产生影响[61]。Oppong等[23]研究表明， 30℃时醚苯磺隆降解半衰期为11～13d， 10℃时为30～79d，温度越高，降解速率越快，田间持水量分别为25%、75%和100%时，醚苯磺隆的降解速率分别为87.5%、97.5%和96.3%。这说明随土壤湿度增加，除草剂降解速率变大，但与温度的影响相比，湿度对降解速率的影响较小[62]。郭正元等研究发现碘甲磺隆钠盐降解速率与土壤温度、湿度呈正相关[13]。水分增加可促进化学水解，并利于微生物代谢降解[62]。
5. 5 其他因素
除了上述土壤pH、微生物数量、化学结构、温度和湿度对磺酰脲类除草剂微生物降解有着重大影响外，其它因子如土壤有机质、降雨量、氧气供应、施用量以及施用时期，亦影响着该类化合物在土壤中的降解速度。如有机质对降解速率的影响主要在于它改变土壤酸碱度，还可通过改变吸附作用和土壤微生物种类、数量影响绿磺隆的降解[63]。
6· 展望
随着磺酰脲类除草剂的开发和广泛应用，由残留物引起的环境问题亦已引起人们的重视。磺酰脲类除草剂除对禾谷类和豆类等作物产生药害外，还对果蔬、麻、地方性植物及森林树种等非靶标类植物有药害[4]。磺酰脲类除草剂在环境中的行为已成为人们关注的问题[47]。磺酰脲类在土壤中降解主要有微生物降解、光解和化学降解，其中光解较少，主要是水解和微生物降解，在各种环境中影响因子不同，不同化合物的生物降解率有所不同。微生物降解是磺酰脲类除草剂降解的重要途径之一。为了更有效、安全、经济地使用该类除草剂，目前对微生物降解磺酰脲类除草剂的研究有一定的探索，但是，如何在自然界中筛选多功能微生物资源；如何使实验室条件下微生物降解与实际应用效果接近；以及如何克服影响微生物降解效果的各种限制因子；构建的工程菌及其农药降解质粒的稳定性及菌种的安全管理；对于农药微生物降解制剂产品、其降解农药能力的评价及产品进人市场的管理应及早有相应的配套法制法规；微生物降解技术在农业生产实践中的具体应用技术等问题有待进一步研究。
参考文献：略